植物内源基因tRNALeu核酸检测试剂盒（一管式PCR-荧光探针法）
◆ 产品说明
转基因检测系列可针对食品、饲料等样品中转基因成分的特异核酸片段进行扩增，通过实时扩增曲线判定结果。本产品用于植物内源基因tRNALeu成分的检测，检出限为0.1%。
◆ 产品组成（48测试）

041122MⅡ
试剂	含量
A-tRNALeu-P	20μL × 8管× 6排
NG -P	100μL × 2支
PG-tRNALeu-P	100μL × 1支

◆ 适用仪器
ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等实时荧光PCR仪。
◆ 自备耗材和仪器
①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；③离心机；④涡旋混匀器；⑤金属浴；⑥均质机、搅拌机或研钵等研磨器具；⑦电子天平。
◆ 注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
1）第一区：样本制备区。
2）第二区：模板添加区。
3）第三区：扩增及产物分析区。
★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
◆ 样品处理
参照《GB/T 19495.3-2004 转基因产品检测 核酸提取纯化方法》或其他标准处理样品，除了处于食物和（或）饲料链起始端的农产品和粗加工材料（如粉碎的产品），大多数工业加工的食品经过了物理、化学及酶的处理。这些处理会降低DNA的含量及纯度。因此，每一方法的适用性及重复性会随特异样品而异，一种特定的DNA提取方法的性质特征依赖于被研究的食品种类。实验室样品的代表性应符合《GB/T 19495.7-2004 转基因产品检测 抽样和制样方法》。制备的样本保存待用。
详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。
★ 若使用非一次性研磨器研磨样品，一定要彻底清洗研磨器并充分干燥后再进行下一份样品的研磨，防止交叉污染。
◆ 实验操作
1.模板制备（样本制备区）
建议使用配套植物基因组DNA提取试剂盒，具体过程详见产品说明书。
2.添加模板（模板添加区，放置于冰盒上进行）
剪下所需测试数的已含有反应液的PCR管，放置在室温待解冻后，离心30秒后揭开封口膜，向每管反应液中分别加入5μL模板，顺序为NG、待测样品模板、PG-tRNALeu-P。盖好配套的PCR管盖后，涡旋混匀30s，离心1min，立即进行PCR扩增反应。
3.扩增反应（扩增及产物分析区）
使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择TAMRA。
按下列条件设置扩增反应：

PCR循环			荧光收集位点
95℃	10分钟	1个循环	—
95℃	15秒	40个循环	—
60℃	1分钟		※

• 基线和阈值设定

基线调整取3-15个循环的荧光信号，阈值线应超过阴性对照扩增曲线的最高点
◆ 结果判定
检测样品无Ct值或≥40，曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线，可报告样品阴性，不含有植物内源基因tRNALeu或含量低于检出限；
检测样品Ct≤36，曲线呈“S”型扩增曲线，可直接报告样品阳性，含有植物内源基因tRNALeu；
检测样品36＜Ct＜40，需进行一次重复实验，若Ct值仍处于36和40之间且呈“S”型扩增曲线，同时各种实验对照结果正常，报告样品阳性，否则报告样品阴性。
★NG反应为平滑直线，PG反应为“S”型扩增曲线，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。