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谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)试剂盒说明书
发布时间:2018-07-16 17:21 | 点击次数:
谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)试剂盒说明书
分光光度法 50 管/24 样正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义
GS(EC 6.3.1.2)主要存在于植物中,是生物体内氨同化的关键酶之一,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺,不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性,而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式。测定原理
GS 在 ATP 和 Mg2+存在下,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺;谷氨酰胺进一步转化为 γ─ 谷氨酰基异羟肟酸,在酸性条件下形成的络合物在 540nm 处有最大吸收峰,可用分光光度计测定。所需的仪器和用品
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。试剂的组成和配制
提取液:30mL×1 瓶,4℃保存。试剂一:12mL×1 瓶,-20℃保存,临用前 37℃预热 20min,充分混匀,如有沉淀,静置 10min, 取上清待用。
试剂二:12mL×1 瓶,-20℃保存,临用前 37℃预热 20min,充分混匀,如有沉淀,静置 10min, 取上清待用。
试剂三:粉剂×2 瓶,-20℃保存。用时每瓶加入 5mL 蒸馏水充分溶解待用。试剂四:15mL×1 瓶,4℃保存。
样本测定的准备
1、细菌、细胞或组织样品的制备:细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量
(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤
1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 540nm,蒸馏水调零。2、 在 EP 管中加入下列试剂:
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 400 | |
试剂二 | 400 | |
试剂三 | 175 | 175 |
样本 | 175 | 175 |
试剂四 | 250 | 250 |
混匀,25℃室温静置 10min 后,5000g,25℃离心 10min,取上清液测定 540nm 处的吸光值
A。△A=A 测定管-A 对照管。每个测定管需设一个对照管。
GS 活力单位的计算
标准曲线:y = 0.8348x + 0.0008,R2 = 0.9999
1、血清(浆)GS 活性
单位定义:每 mL 血清(浆)在每 mL 反应体系中每小时产生 1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。
计算公式:
GS(μmol/h/mL)=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反总÷V 样÷T
=10.268×ΔA
2、组织、细菌或细胞 GS 活性
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中每小时产生 1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。
GS(μmol/h/mg prot)=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T
=10.268×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织在每 mL 反应体系中每小时产生 1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。
GS(μmol/h/g 鲜重)=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷T
=10.268×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位定义:每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中每小时产生 1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。
GS(μmol/h/104 cell)=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷T
=0.021×ΔA
V 反总:反应体系总体积,0.75mL; V 样:加入样本体积,0.175mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;
500:细菌或细胞总数,500 万。