牛源性成分核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
 
◆ 产品说明
             物种鉴定系列可针对食品、饲料等样品中动物源性成分的特异核酸片段进行扩增，通过实时扩增曲线判定结果。本产品用于牛源性成分的检测，检出限为0.1%。
◆ 产品组成（48测试）
 

021022M
试剂	含量
A-牛源-P	1000μL × 1支
NG-P	100μL × 2支
PG-牛源-P	100μL × 1支

 
◆ 适用仪器
    荧光PCR仪（ABI 7500，CFX 96，Mx 3005P，LineGene9600）等PCR扩增仪。
◆ 自备耗材和仪器
    ①灭菌1.5mL或2.0mL离心管；②灭菌0.2mL PCR管或八联管；③冰盒；④移液器（1-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；⑤离心机；⑥涡旋混匀器；⑦金属浴。
◆ 注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
   1）第一区：试剂准备区。
   2）第二区：样本制备区。
   3）第三区：扩增及产物分析区。
   ★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2. 实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，使用移液器，试验产生的所有废弃物及时处理。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
◆ 样品处理
参照《SB/T 10923-2012 肉及肉制品中动物源性成分的测定 实时荧光PCR法》或其他标准处理样品，制备的样本保存待用。
样品的采集和制备是动物源性鉴别的重要步骤，为防止交叉污染，应使用一次性消耗品，研钵应经160℃干烤2 h，其他不宜干烤或高压处理的器皿应使用1%次氯酸钠溶液浸泡。
取样应尽量采取肌肉组织，对于同一批样品，应多点采集合并后，作为一份样品进行均质，提取DNA。
采样过程应快速完成，将采取的样品迅速放入组织搅碎机中进行均质成糜状，充分混匀，取0.1 g充分混匀的样品，采用液氮研磨或均质器均质。
详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。
 
◆ 实验操作
将试剂完全解冻，各组分离心30s。
1. 试剂配制（试剂准备区，放置于冰盒中进行）：
若有N个待检样品，则参照下表，按照N+2个数量计算反应液用量（N个待检样品+1个阴性对照+1个阳性对照），涡旋混匀，离心30s，分装于0.2mL PCR管中。
 

试剂	使用量
A-牛源-P	20×(N+2)μL
反应液总体积	20×(N+2)μL

 
2．模板制备（样本制备区）
   建议使用试剂配套动物源性成分DNA提取系列产品，具体过程详见产品说明书。
3．添加模板（样本制备区，放置于冰盒中进行）
      在步骤1中已含有反应液的PCR管中加入5μL模板，顺序为NG-P、待测样品模板、PG-牛源-P。涡旋混匀30s，离心1min，立即进行PCR扩增反应。
4. 扩增反应（扩增及产物检测区）
   使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择TAMRA。
   按下列条件设置扩增反应：
 

PCR循环			荧光收集位点
95℃	10分钟	1个循环	—
95℃	15秒	40个循环	—
60℃	1分钟		※

5.基线和阈值设定
  基线调整取3-15个循环的荧光信号，阈值线应超过阴性对照扩增曲线的最高点
◆ 结果判定
检测样品无Ct值，曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线，可报告样品阴性，不含有牛源性成分或含量低于检测限；
检测样品Ct≤35，曲线呈“S”型扩增曲线，可直接报告样品阳性，含有牛源性成分；
检测样品Ct＞35，可直接报告样品阴性，不含有牛源性成分或含量低于检测限。

• NG反应为平滑直线，PG反应为“S”型扩增曲线，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。