猪源性成分核酸检测试剂盒（一管式PCR-荧光探针法）
 
◆ 产品说明
物种鉴定系列可针对食品、饲料等样品中动物源性成分的特异核酸片段进行扩增，通过实时扩增曲线判定结果。本产品用于猪源性成分的检测，检出限为0.1%。
◆ 产品组成（48测试）

021012MⅡ
试剂	含量
A-猪源-P	20μL × 8管× 6排
NG-P	100μL × 2支
PG-猪源-P	100μL × 1支

 

• 适用仪器

    ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等实时荧光PCR仪。
◆ 自备耗材和仪器
 ①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；③离心机；④涡旋混匀器；⑤金属浴。
◆ 注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
   1）第一区：样本制备区。
 2）第二区：模板添加区。
   3）第三区：扩增及产物分析区。
   ★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
◆ 样品处理
参照《SN/T 3730.8-2013 食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第8部分：猪成分检测 实时荧光PCR法》或其他标准处理样品，制备的样本保存待用。
样品的采集和制备是动物源性鉴别的重要步骤，为防止交叉污染，应使用一次性消耗品，研钵应经160℃干烤2 h，其他不宜干烤或高压处理的器皿应使用1%次氯酸钠溶液浸泡。
取样应尽量采取肌肉组织，对于同一批样品，应多点采集合并后，作为一份样品进行均质，提取DNA。
采样过程应快速完成，将采取的样品迅速放入组织搅碎机中进行均质成糜状，充分混匀，取0.1 g充分混匀的样品，采用液氮研磨或均质器均质。
详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。
◆ 实验操作
1.模板制备（样本制备区）
  建议使用试剂配套动物基因组DNA提取系列产品，具体过程详见产品说明书。
2.添加模板（模板添加区，放置于冰盒上进行）
  剪下所需测试数的已含有反应液的PCR管，放置在室温待解冻后，离心30秒后揭开封口膜，向每管反应液中分别加入5μL模板，顺序为NG、待测样品模板、PG-猪源-P。盖好配套的PCR管盖后，涡旋混匀30s，离心1min，立即进行PCR扩增反应。
3.扩增反应（扩增及产物分析区）
   使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择TAMRA。
   按下列条件设置扩增反应：
 

PCR循环			荧光收集位点
95℃	10分钟	1个循环	—
95℃	15秒	40个循环	—
60℃	1分钟		※

4.基线和阈值设定
  基线调整取3-15个循环的荧光信号，阈值线应超过阴性对照扩增曲线的最高点
◆结果判定
检测样品无Ct值，曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线，可报告样品阴性，不含有猪源性成分或含量低于检出限；
检测样品Ct≤35，曲线呈“S”型扩增曲线，可直接报告样品阳性，含有猪源性成分；
检测样品Ct＞35，可直接报告样品阴性，不含有猪源性成分或含量低于检测限。

• NG反应为平滑直线，PG反应为“S”型扩增曲线，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。