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诺如病毒GI型、GII型RNA核酸检测试剂盒(一管式IAC,PCR-荧光探针法)
发布时间:2018-07-16 10:30 | 点击次数:
诺如病毒GI型、GII型RNA核酸检测试剂盒(一管式IAC,PCR-荧光探针法)
◆ 产品说明
诺如病毒GI型、GII型RNA核酸检测试剂盒(PCR-双色荧光法)参照GB 4789.42-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验》进行设计,可于一个反应中同时检测GI型、GII型诺如病毒;适用于贝类,生食蔬菜,胡萝卜、瓜、坚果等硬质表面食品,草莓、西红柿、葡萄等软质水果等食品中GI型、GII型诺如病毒核酸的检测。
◆ 产品组成(48测试)
012172MⅡ | |
试剂 | 含量 |
A-GIGII | 20μL× 7管× 4排 |
IAC-Nor | 20μL× 5管× 4排 |
B-Nor | 500μL × 1支 |
NG-P | 100μL × 2支 |
PG-Nor | 100μL × 1支 |
ABI 系列、MJ 系列、Roche 系列、博日系列以及其它荧光定量PCR 检测仪(可同时检测FAM通道(494 nm)、VIC通道(538nm)两种通道的荧光定量PCR仪)。
◆ 自备耗材和仪器
①冰盒;②移液器(1-10μL,10-100μL,100-1000μL)及配套灭菌吸头(RNase free);③离心机;④涡旋混匀器。
◆ 注意事项
1.本试剂检测灵敏度高。为了防止污染,实验要分区操作。
1)第一区:样本制备区。
2)第二区:扩增及产物分析区。
★ 分区之间最好进行物理性隔离,避免人为因素造成的污染。
2.实验过程中穿戴工作服和乳胶手套,不同区域独立使用工具,需更换手套和实验服。
3.严格按照操作步骤操作,试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4.反应液中的成分对光敏感,应避光保存。试剂使用前要完全解冻,但应避免反复冻融,推荐使用前离心30秒,并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
5.反应结束后,扩增管请置于密封袋内丢弃,当日清理,开盖易造成气溶胶污染,禁止开盖。
6.不同批号试剂请勿混合使用,在有效期内使用。
◆ 试剂盒组分及样品处理说明
(1)样品前处理请参照GB 4789.42-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验》进行样品前处理。
(2)A-GIGII为GI、GII反应液,含有诺如病毒GI型、GII型引物探针。
(3)IAC-Nor为过程控制反应液,含有过程控制病毒引物探针。
(4)B-Nor为提取过程控制液,进行样品RNA提取时请参照国标法加入10 μL B-Nor作为提取过程控制;亦可参照国标法另取50-100 μL B-Nor,用PBS缓冲液补足至200 μL,进行核酸提取、标准曲线制作及计算提取效率。
(5)NG-P为阴性对照,也可参照国标法提取阴性样品核酸作为阴性对照进行实验。
(6)PG-Nor含GI型、GII型诺如病毒核酸,可作为阳性对照,亦可参照国标法作为扩增控制计算抑制指数。
*推荐使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒中的方案进行病毒RNA的提取,或者采用其他等效产品进行RNA提取。
◆ 实验操作(推荐)
1. 反应体系配制(样本制备区)
剪下所需测试数的已含有反应液的PCR管,并参照下表进行编号,放置在室温待解冻后,离心30秒后揭开封口膜,使用穿刺加样法穿过固封层向每管反应液中分别加入模板。
孔编号 | 实验意义 | 反应液 | 加入模板 |
A | 空白对照 | A-GIGII | 5μL RNase free water |
B | 阴性对照 | A-GIGII | 5μL阴性对照 |
C | 病毒提取过程控制1 | IAC-Nor | 5μL样品RNA |
D | 病毒提取过程控制2 | IAC-Nor | 5μL过程控制病毒RNA |
E | 病毒提取过程控制3 | IAC-Nor | 5μL 10-1倍稀释过程控制病毒RNA |
F | 病毒提取过程控制4 | IAC-Nor | 5μL 10-2倍稀释过程控制病毒RNA |
G | 病毒提取过程控制5 | IAC-Nor | 5μL 10-3倍稀释过程控制病毒RNA |
H | 扩增控制1 | A-GIGII | 5μL样品RNA+1μL扩增控制RNA |
I | 扩增控制2 | A-GIGII | 5μL 10-1倍稀释样品RNA+1μL扩增控制RNA |
J | 扩增控制3 | A-GIGII | 5μL RNase free water+1μL扩增控制RNA |
K | 样品1 | A-GIGII | 5μL样品RNA |
L | 样品2 | A-GIGII | 5μL 10-1倍稀释样品RNA |
*请参照上表对管进行编号,以免混淆。
2. 扩增反应(扩增及产物分析区)
使用荧光定量PCR仪进行检测,编号A~B,H~L使用FAM和VIC通道,编号C~G使用FAM通道。
按下列条件设置扩增反应:
PCR循环 | 荧光收集位点 | ||
50℃ | 10分钟 | 1个循环 | — |
95℃ | 5分钟 | 1个循环 | — |
95℃ | 10秒 | 45个循环 | — |
60℃ | 30秒 | ※ |
1. 实验有效性判定
(1)实验满足:空白对照阴性(A反应孔);阴性对照阴性(B反应孔);阳性对照阳性(J反应孔);否则本次实验无效,请与本公司技术支持联系。
(2)过程控制(C~G反应孔)需满足:提取效率≥1%;如提取效率<1%,需重新检测;但如提取效率<1%,检测结果为阳性,也可酌情判定为阳性。
(3)扩增控制(H~J反应孔)需满足:抑制指数<2.00;如抑制指数≥2.00,需比较10倍稀释样品的抑制指数;如 10 倍稀释样品扩增的抑制指数<2.00,则扩增有效,且需采用10倍稀释样品RNA的Ct 值作为结果;10倍稀释样品扩增的抑制指数也≥2.00时,扩增可能无效,需要重新检测;但如抑制指数≥2.00,检测结果为阳性,也可酌情判定为阳性。
2. 结果判定
待测样品的Ct值大于等于45时,判定为诺如病毒阴性;待测样品的Ct值小于等于38时,判定为诺如病毒阳性;待测样品的Ct值大于38,小于45时,应重新检测;重新检测结果大于等于45时,判定为诺如病毒阴性;小于等于38时,判定为诺如病毒阳性。